ヒトiPS細胞を用いた、杯細胞を含有する機能的結膜上皮の作製

研究の概要

我々の研究グループは、ヒトiPS細胞からムチン分泌能を有する機能的な結膜上皮を作製する方法を新たに確立しました。眼球の表面は角膜と結膜からなり、結膜は涙液層の維持を担っていますが、その機能が低下すると眼の表面が乾燥し、ドライアイなどの疾患になります。今回、我々はヒトiPS細胞から誘導した二次元の眼オルガノイド用い、EGF受容体シグナルを活性化することで結膜細胞を選択的に誘導できることを見出しました。さらに、セルソーターを用いて単離したiPS細胞由来の結膜上皮前駆細胞のさらなる成熟培養を行った結果、結膜上皮および杯細胞への分化にはKGFが必要であることを明らかにしました（図1）。本研究成果により、これまで困難であったヒト結膜細胞の大量入手が可能となり、ドライアイなどに対する創薬研究や再生医療研究において大きな進捗が期待されます。

研究の背景と結果

眼の表面は主に結膜上皮と角膜上皮からなり、角膜は黒目の部分を、結膜はまぶたの裏側と眼球の表面から黒目の周囲までを覆っています。結膜上皮の重要な役割として涙液中にムチン（MUC5ACなど）を分泌することで眼の表面を保護していますが、疾患や炎症などにより結膜からのムチン分泌機能が低下すると、眼の表面が乾燥しドライアイとなります。これまでに我々は、ヒトiPS細胞を用いた様々な眼の細胞を含むオルガノイドである多帯状コロニー（Self-formed Ectoderm Autonomous Multi-zone; SEAM、図1）の誘導法を確立し、SEAMを用いて角膜上皮組織の作製に成功しています。一方で、同じ眼表面上皮である結膜上皮の分化誘導法は不明でした。そこで本研究では、成長因子を適切な条件下で使い分けることでSEAMからの結膜細胞の誘導、単離、成熟を目指しました。我々はまずヒトiPS細胞からSEAM形成後にEGFもしくはKGFを添加した際の変化を比較検討しました。EGF添加SEAM（+EGF）とKGF添加SEAM（+KGF）では、両者とも分化開始6週目でSEAMのzone 3にp63+/PAX6+の眼表面上皮原基（角結膜上皮の原基）が誘導されました。一方10週の時点では、EGFを添加した場合では角膜上皮細胞への分化が強く抑制されることがわかりました（図2A–B）。続いて、EGF添加SEAMを3種類の細胞表面マーカー（CD200, SSEA-4, ITGB4）で染色後、FACSで6つの画分に分離し詳細に解析しました（図3A）。その結果、CD200陰性/SSEA-4弱陽性/ITGB4陽性の画分（P2）の細胞を重層化培養することで、結膜杯細胞を含む成熟した結膜上皮に分化することが明らかとなりました。興味深いことにこの成熟培養の際には、EGFではなくKGFを添加した条件で結膜杯細胞マーカーMUC5ACの発現上昇が認められました（図3B–C）。さらに本研究で作製したヒトiPS細胞由来結膜上皮シートはMUC5AC分泌能も確認され（図3D）、結膜マーカーの免疫染色やムチン染色でも正常な結膜上皮と同じ特徴が確認されました（図3E–F）。
本研究により眼表面上皮細胞から結膜上皮前駆細胞への分化にはEGFなどのEGF受容体リガンド、結膜上皮前駆細胞から結膜上皮への成熟にはKGFが重要であることが示唆されました。

研究の意義と将来展望

本研究成果により、これまで入手が困難であったヒト結膜細胞をiPS細胞から分化誘導し、結膜や角膜を含む、眼表面上皮の機能解析や発生過程を解明するための研究ツールとして利用することが可能となりました。さらには、結膜細胞をターゲットとしたドライアイなどの眼疾患に対する創薬研究への利用や、眼表面の再生治療法開発のための研究ツールとして提供できることも期待されます。

担当研究者

寄附講座教授 林 竜平、特任研究員 能美 君人（医学系研究科　幹細胞応用医学寄附講座）

キーワード

結膜上皮／杯細胞／EGF／KGF／SEAM

応用分野

再生医療／創薬研究／発生生物学

参考URL

https://resou.osaka-u.ac.jp/ja/research/2021/20210203_1
https://www.amed.go.jp/news/release_20210203-02.html

※本内容は大阪大学共創機構 研究シーズ集2022（未来社会共創を目指す）より抜粋したものです。